sikFBA4基因启动子的克隆及低温表达模式分析

天山雪莲生长于常年积雪覆盖高海拔处的高山区域,具有很强的极端低温生境适应能力,属于研究植物低温适应的良好模式植物。前期的研究表明,sikFBA4基因可以显著提高番茄的抗寒能力。为进一步研究sikFBA4基因的耐寒响应模式,以天山雪莲为材料,采用实时荧光定量PCR分析sikFBA4在低温胁迫下的表达模式;利用高效热不对称PCR法(Hi-Tail PCR)克隆sikFBA4启动子序列并进行生物信息学分析。为分析PsikFBA4序列克隆的完整性及转录表达特性,将PsikFBA4与GUS基因融合在烟草中进行瞬时表达。结果表明,sikFBA4在低温胁迫条件下的表达发生瞬时显著上调,并在1 h达到峰值,而后表达下调。通过启动子克隆分析,在PsikFBA4序列-1648 bp位置处具有冷响应元件LTRE;进一步的GUS染色和酶活力测定结果表明,低温能够显著提高GUS基因的表达活性,说明sikFBA4属于低温诱导型基因。SikFBA4基因启动子的克隆、序列分析以及表达分析,为进一步探究雪莲果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(sikFBAs)基因的表达与调控机制奠定了基础。     

菊花ClERF1基因的克隆与表达分析

以甘菊叶片为试验材料,采用RT-PCR和Tail-PCR以及生物信息学的方法,研究了甘菊ClERF1及其启动子序列特征、表达模式,以及甘菊ClERF1在低温胁迫下的响应。以期为进一步研究甘菊ClERF1功能提供参考依据。结果表明:ClERF1基因序列全长1 242 bp,最大开放阅读框(ORF)618 bp,可编码206个氨基酸。经理化性质分析,ClERF1分子量23 631.35 Da,理论等电点5.19,不稳定系数53.84,脂肪指数62.04,平均亲水性-0.786,亚细胞定位在细胞核内。系统进化树表明,ClERF1与拟南芥At3g23240亲缘关系最近,属于ERF亚家族。qRT-PCR分析表明ClERF1在叶片中表达最高,其次在茎段中。该研究克隆了ClERF1启动子序列1 534 bp,主要包括低温反应和乙烯响应元件、生长素和茉莉酸甲酯反应元件等。甘菊低温处理幼苗ClERF1表达量显著高于未低温处理的幼苗,其中5℃时ClERF1相对表达量最高。     

马铃薯地上部绿色组织中糖苷生物碱合成调控的研究

为提高马铃薯品种(系)地上部分糖苷生物碱(SGAs)的含量,增强其抗逆性并改良块茎的品质。克隆了马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)cDNA和1,5–二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因启动子(rbcS P);对sgt3亚细胞定位预测显示,该蛋白不具有叶绿体转运肽、线粒体导肽和分泌信号肽序列,推测可能位于细胞质;将克隆的sgt3 cDNA片段及rbcS重组到pCEPSP载体上,构建了具有草甘膦抗性标记的绿色组织特异表达sgt3基因植物表达载体。通过农杆菌介导法对马铃薯品种‘陇薯3号’和‘夏波蒂’进行转化,共获得了12株抗草甘膦的阳性转基因植株。对转基因植株的目的基因表达水平和SGAs含量分析发现,地上部sgt3基因相对表达量较未转化植株提高1.3~3.0倍,SGAs含量增加20%~37%,而转基因植株的块茎中SGAs含量变化不显著。本研究的结果为进一步培育枝、叶中高SGAs而块茎中低SGAs的马铃薯抗性品种提供了理论依据。     

花生种子特异启动子AHSSP1的克隆及功能分析

为丰富花生种子特异启动子资源,本研究利用PCR技术在花生基因组中克隆了种子贮藏蛋白基因PSC32的启动子AHSSP1,利用半定量RT-PCR检测了PSC32基因表达模式,借助NewPLACE在线分析了AHSSP1序列中存在的顺式作用元件,并构建了AHSSP1驱动GUS报告基因的表达载体,经农杆菌转化获得转基因拟南芥,经GUS组织化学染色鉴定了该启动子的功能。结果表明,PSC32基因957 bp长的启动子AHSSP1序列具备种子特异表达启动子特有的3个RY REPEAT元件。半定量RT-PCR分析发现,PSC32基因在花生成熟种子中表达,而在饱果成熟期根、茎、叶片、花、入土前的果针、成熟种子的果壳中均不表达。GUS组织化学染色发现,转基因拟南芥成熟种子以及萌发种子的子叶、下胚轴和胚根均能够被染上蓝色;长出真叶后,子叶和下胚轴仍能被染色,而根和真叶不能被染上蓝色;成年期转基因拟南芥的叶片也不能被染上蓝色。而野生型拟南芥整个生长时期均不能被染上蓝色。以上现象说明AHSSP1是一个种子特异启动子。本研究丰富了花生种子特异启动子的资源,对花生籽仁品质改良或以花生籽仁作为“生物反应器”的研究具有重要的应用价值。     

植物提取物应用于水产饲料的研究进展

植物提取物因其安全、绿色和高效等特点已成为目前替代抗生素的研究热点。植物提取物含有多种有效成分，具有多种生理活性，应用于不同水产动物效果不同。本文分别从诱食性、促生长、免疫增强、抗氧化应激和抗病原菌五个方面，综述了植物提取物在水产饲料中的最新研究进展，为开发环保型饲料添加剂提供理论参考。     

荔枝FKBP16-2基因启动子的克隆与瞬时表达分析

前期研究中发现了一个果肉低表达而叶片中高表达的荔枝基因FKBP16-2。本文克隆了该基因1 578 bp的启动子片段并对其功能进行了初步分析,结果表明:荔枝FKBP16-2基因启动子序列中含有大量的TATA-box和CAAT-box保守元件,以及TCA-element,ARE,HSE,GCN4_motif,O2-site等各种转录调控相关的顺式作用元件。该启动子能驱动GUS基因在荔枝的花、叶、根、果皮以及种子中表达而在果肉中不表达,表达具有组织特异性。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料，利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平；利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能；利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平；利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒，分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示，高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）；TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点，且在启动子的近端和远端均有分布，但不存在CpG岛；将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域，分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）；高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）；R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438，P<0.05；R3区域：r=0.371，P<0.05；R2+R3区域：r=0.489，P<0.05）；R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述，TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

Polymorphism of P53‐Ets/AP1 transactivation region of MDM2 oncogene and its immunohistochemical analysis in canine tumours

Mouse Double Minute‐2 (MDM2) is an ubiquitin ligase which is overexpressed or its promoter polymorphism has been reported in different tumours. The objective of this study was to examine the MDM2 protein expression and its promoter polymorphism in some canine tumours. Twenty specimens were collected from 20 dogs with 15 mammary gland carcinomas, 3 lymphomas, 1 transmissible venereal tumour and 1 trichoblastoma. Samples were analysed immunohistochemically using human antibody against MDM2 protein. PCR and DNA sequencing were carried out to identify MDM2 promoter polymorphism. MDM2 gene was expressed in 13 of 20 samples including 11 mammary carcinomas, 1 lymphoma and 1 trichoblastoma. We found 94% homology between canine and human sequences. Four mutations including G169C, A177G, G291T and A177G were identified in different types of breast carcinomas. An extra p53 response element was found in a mixed mammary carcinoma.     

Two single nucleotide polymorphisms in the promoter of the ovine myostatin gene (MSTN) and their effect on growth and carcass muscle traits in New Zealand Romney sheep

Myostatin is a negative regulator of muscle growth and development in mammals, and variation in ovine myostatin gene (MSTN) has been demonstrated to be associated with variation in the muscularity of sheep. Polymerase chain reaction–single‐stranded conformational polymorphism (PCR–SSCP) was used to look for single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a 304‐bp amplicon from the promoter region of ovine MSTN. Sequence analyses revealed two previously identified SNPs (c.?2449G/C and c. ?2379T/C) that resulted in three haplotypes (H₁ (c.[?2449G; ?2379C]), H₂ (c.[?2449C; ?2379C]) and H₃ (c.[?2449G; ?2379T]). The effect of these SNPs on growth and carcass traits was investigated in 357 NZ Romney lambs. General linear mixed‐effect models revealed that sheep with the genotype c.?2449GC had a higher loin meat yield (p = 0.032) and proportion loin yield (p = 0.028), than those with the genotype c.?2449GG. The genotype c.?2379CC was associated with an increase in three weight traits: birthweight (p = 0.003), tailing weight (p = 0.009) and weaning weight (p = 0.028), when compared with the genotype c.?2379TC, but it was not found to have an association with growth rate. This suggests that c.?2379T/C has an effect that originates at, or before birth. Haplotype H₃ was associated with a decrease in birthweight (p = 0.002), tailing weight (p = 0.003) and weaning weight (p = 0.011). Haplotype H₂ was associated with increased loin yield (p = 0.012) and proportion loin yield (p = 0.002). The SNPs may have value as genetic markers for improved Romney breeding.     

中国野生葡萄抗霜霉病相关基因VpPR4b及其启动子的克隆和功能分析

以中国野生葡萄(Vitis piasezkii)‘留坝-8’(抗霜霉病)和欧亚种葡萄(V.vinifera)‘黑比诺’(易感霜霉病)为材料,克隆得到抗霜霉病相关基因VpPR4b和VvPR4b。序列分析发现VpPR4b和VvPR4b核苷酸序列相似性为98.61%。VpPR4b编码区为432 bp,编码143个氨基酸,含有BARWIN保守结构域,属于典型的Ⅱ型PR4蛋白。VpPR4b和VvPR4b均可在霜霉菌侵染后诱导表达。亚细胞定位表明VpPR4b定位于细胞膜上。分别从‘留坝-8’和‘黑比诺’中克隆得到了VpPR4b和VvPR4b的启动子,其序列相似性高达95.65%,并且含有相似的顺式作用元件。通过酵母单杂交验证了转录因子WRKY40和WRKY75可以结合VpPR4b启动子。本研究的结果表明PR4b可能在葡萄抵御霜霉病侵染过程中发挥一定作用。